广东省水产中孔雀石绿残留检测和分析

在水产养殖过程中，兽药一直被广泛应用。兽药有很多种类，包括：抗生素、抗寄生虫药、非类固醇消炎药如β 受体激动剂等。一方面，兽药可以预防或者治疗水产品受到的感染；另一方面，兽药可以促进水产品增重，并且在运输过程中起到镇定的作用。使用兽药后，水产品体内会蓄积或储存药物或者其代谢产物。我国对兽药的使用有严格的要求，建立了动物性食品中兽药最大残留标准[1]。未按规定合理使用或者非法使用违禁药品会导致兽药残留量超过国家规定的最高残留限量。残留兽药可通过食物链转移到人体内并在人体内蓄积，从而影响人体健康，引发食品安全问题。其中，孔雀石绿是一种过去非常有效的抗真菌感染兽药。但它会对人体的肝、脾和肾造成损伤，具有致畸和致癌作用。所以目前我国明确禁止在水产养殖中添加孔雀石绿。但由于孔雀石绿易于获得、便宜且非常有效，仍有养殖人员违反规定，私自使用孔雀石绿。因此，检测水产品中孔雀石绿残留对于水产品安全性评估和保护人体健康非常必要。

目前报道的水产品中孔雀石绿的检测方法主要有酶联免疫法[2]、高效液相色谱和质谱法[3]。这些方法有较高的灵敏度，但操作复杂，或者需要昂贵的仪器，不利于大范围推广使用。本方法运用胶体金免疫层析法加标盲样测试，并对广东省千家农贸市场的食用水产品的孔雀石绿残留情况进行筛查，同时通过液质联用法（LC-MS）进行复核。最后对2016—2019 年的孔雀石绿检出情况进行分析，为广东省相关部门开展水产品安全监督管理工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高效液相色谱质谱（LC-MS）仪：TSQ Access MAX（Thermo Fisher Scientific）。

分析天平SQ（sartorius）；均质器（IKA）；台式高速离心机TG-16C（长沙英泰）；固相萃取装置SPE VM12（Sigma Supelco）；氮吹仪HSC-24A（天津恒奥）；单道移液枪Transferpette? S（BRAND）；旋涡混合器XW-80A（海门其林贝尔）；旋转蒸发仪（上海亚荣）。

孔雀石绿快筛试剂盒（广州安诺科技股份有限公司）；孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品、同位素内标氘代孔雀石绿（D5-MG）和同位素内标氘代隐色孔雀石绿（D6-LMG）标准品（德国Witega 公司）；乙腈、甲醇（均为色谱纯）；盐酸羟胺、甲苯-4-磺酸、二氯甲烷、冰乙酸、无水乙酸胺及甲酸（均为分析纯）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理

取约200 g 去除脂肪组织的肌肉样品，用均质机均质。取5 g（ g）均质物至50 mL 离心管中，加入1 瓶试剂盒中的试剂A、4 mL 乙腈，剧烈振荡3 min，再加入1 瓶试剂B，剧烈振荡2 min， 4 000 r·min-1离心5 min；取1.2 mL 上清液至5 mL 离心管中，加入100 μL 试剂C，上下颠倒混匀；然后置于氮吹仪中，于65 ℃吹干；向吹干的离心管中加入300 μL 试剂D，复溶离心管壁残留物，静置待测。

1.2.2 样品的测定

吸取120 μL 待测液至金标微孔，静置反应2 min后，用吸管吹打孔内空色物质完全溶解；将检测卡平放，吸取孔内所有溶液至加样孔中，5 min 后判读结果，超过30 min 后判读无效。①阴性。T 线颜色比C线深或一样深，表示样品中待检药物浓度低于检出限。②阳性。T 线颜色明显比C 线浅，或T 线呈绿色，表示样品中待检药物浓度高于检出限。③无效。未出现C 线，可能是操作不当或检测卡已失效。应再次阅读说明书，并用新的检测卡重新测试，可参照图1 进 行判读。

图1 判读示意图

1.2.3 方法验证

（1）加标盲样测试。取经实验室检测确认为阴性的具有代表性的水产品（如草鱼、罗非鱼、黄骨鱼、小黄鱼、基围虾、塘鲺、蛏子、白贝、花甲、泥鳅及鱿鱼等），均质，添加孔雀石绿或隐色孔雀石绿标准品至样品中，使其浓度分别为0.0、2.0、4.0 μg·kg-1，每个浓度下设置50 个样品，按照上述胶体金免疫层析法进行检测。得出2.0 μg·kg-1为该胶体金免疫层析法的检出限。

（2）实际样品测试。从广东省汕尾市、湛江市、肇庆市、梅州市、珠海市及清远市等地的快检室抽取水产样品，运用胶体金免疫层析法对其孔雀石绿残留情况进行筛查，并将样品同时送往广州安诺分析测试中心理化实验室，用LC-MS 进一步复核，检测方法参考 GB/T -2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》。

2 结果与分析

2.1 孔雀石绿快筛试剂盒加标盲样测试验证结果

如表1 所示，一共检测的150 个样品中，149 个样品的结果正确。在检出限浓度为2.0 μg·kg-1的条件下，有一例样品未检出残留。本次检测假阳性率为0%，假阴性率为0.67%。该胶体金免疫层析法满足国家总局《水产品中孔雀石绿的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ）》的要求（假阴性率应≤1%，假阳性率应≤15%）。

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